聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的环保特性及其在材料工程中的应用前景

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Introduction

聚-β-羟基丁酸酯(PHB)是一种天然产物,它可以用于保存微生物的能量并且参与代谢过程。PHB 材料具有环保无毒的特性,同时还有良好的生物相容性,在材料工程学领域应用广泛,能够用作药物缓释载体,其热加工性能良好,在农用和食用包装材料等方面也有着潜在的应用价值。PHB 在环境中能够完全降解成为水和二氧化碳。它对人体不存在危害。在环境压力不断加剧且能源危机日益严峻的当下,PHB 受到了人们的普遍关注。

利用诸如活性污泥、木质素、纤维素等廉价碳源来合成 PHB,这是生产 PHB 的一个重要研究方向。牡丹是我国独有的木本花卉以及药用植物,每年会有众多牡丹籽被采收,这些牡丹籽被用于生产牡丹籽油。在实际操作中,牡丹果荚和牡丹籽通常是一同进行采收的,之后在晾晒完成后再进行分离,这就使得会产生大量的果荚弃置物。弃置物堆积且被废弃,这会造成环境污染;弃置物还会被产地农民当做低值柴薪使用。在研究中发现,牡丹弃置物含有丰富的木质纤维素(包括纤维素、半纤维素、木质素)。那么,如何利用木质纤维素来提高牡丹果荚的利用率,就成为了亟待解决的问题。

山东省农业科学院的王军华博士以及周庆新(他们是共同第一作者),还有陈蕾蕾研究员,以及奥本大学的王易芬教授(他们是共同通信作者)等,采用碱法对牡丹果荚进行了预处理,把利用酶水解得到的还原糖当作碳源,用含 pBHR68 质粒的重组大肠杆菌来发酵制备 PHB,从而拓展了牡丹果荚综合利用的新路径。

Results

生物质样品的傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

FTIR 光谱表明预处理前后吸收峰的形状与强度存在差别。预处理之后,1722cm−1 位置处的吸收峰不见了,这是因为半纤维素支链中的未偶联羰基发生了断裂;1240cm−1 位置处的吸收峰高度有所降低,其原因是半纤维素与木质素之间的连接出现了断裂。此外,处理组在 1376cm-1 处的吸收峰高度有所降低。这表明半纤维素中的 C—H 键出现了部分断裂。同时,一些吸收峰并未发生显著改变,像 3426cm−1、2919cm−1、1425cm−1 这些。这表明预处理没有对纤维素造成破坏。在 2 种碱预处理方式,即微波加热和水浴加热中,它们对纤维素 - 木质素的破坏作用没有显著的差异。

图1 不同处理的牡丹果荚的FTIR图谱

酶水解生成还原糖及其水解产物分析

在相同 pH 值的情况下,柠檬酸钠起到缓冲溶液的作用,使得纤维素酶的水解效果更为充分,酶解效率提升了 37.40%。当进行 24 小时酶解时,还原糖的产量有显著的增加。到 36 小时时,水解能够完全。料液比处于 1%至 6%之间时,酶解能够充分进行,然而在此之后,酶解产量大幅度降低,这是因为溶液的粘稠度增加了,从而导致酶解变得不充分。酶添加量增加时,还原糖产量呈现先增加后降低的趋势,在 1000 U/g 这个添加量下,还原糖产量达到最高。经过优化后,确立了纤维素酶水解工艺,即使用 50 mmol/L 柠檬酸钠(pH 5.0)作为缓冲溶液,纤维素酶添加量为 1000 U/g,料液比为 4%,反应时间为 36 h。

1 - 苯基 - 3 - 甲基 - 5 - 吡唑啉酮衍生化法对制备的还原糖进行检测,检测出了甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。其中,主要成分有葡萄糖和木糖,它们的含量分别是 77.13%和 19.90%,二者占总检出还原糖的 97.03%。元素分析结果显示,该还原糖中的氮含量非常少,只有 0.095%;而另一氮含量为 31.69%。

图2 不同酶水解条件下的还原糖产量

PHB结构表征和制备

以酵母提取物作为氮源,酶解还原糖作为碳源,将含 pBHR68 质粒的重组大肠杆菌 JM109 作为生产菌株进行发酵。对目标产物进行次氯酸钠/氯仿提取以及丙酮纯化操作,通过核磁氢谱和 FTIR 分析来确证其结构。在核磁氢谱 1H NMR 中,可以观察到 PHB 单体羟基丁酸的特征峰。FTIR 的峰形与对照样品是一致的。

图3 PHB结构表征

利用核磁氢谱检测技术,以 PHB 标准品作为阳性对照,通过内标法来定量分析发酵液中的 PHB 含量。结果表明,在不添加氮源的情况下,发酵产物中未检测到 PHB,这意味着氮源对于重组大肠杆菌的生长和 PHB 的产生是不可或缺的。接着对酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆粉、酪蛋白和硫酸铵等不同氮源进行了筛选。玉米浆粉有利于 PHB 的积累,酵母浸粉也有利于 PHB 的积累,其中玉米浆粉的作用更为显著。与蛋白胨、酪蛋白和硫酸铵等其他氮源相比,当以玉米浆粉作为氮源时,PHB 产量至少能提高 160%。把市售的葡萄糖作为参照,当使用等量酶解还原糖作为碳源时,PHB 产量提高了 36.67%。

葡萄糖和酵母浸粉。

图4 影响PHB产量的碳源和氮源筛选

Conclusion

水浴加热采用碱法处理牡丹果荚,这种处理使得连接半纤维素和木质素的化学键遭到破坏。经过纤维素酶水解之后,还原糖的产量提升了 27.15%。对酶解参数进行了优化,从而建立起了高效的还原糖酶解制备参数。以酶解还原糖当作碳源,让大肠杆菌进行发酵转化,通过 1H NMR 和 FTIR 分析,证实最终产物为 PHB。玉米浆粉当作氮源时,PHB 的产量达到最高;酶解还原糖作为碳源时,和葡萄糖相比,PHB 的产量提升了 36.67%。此研究既为 PHB 的商业生产提供了廉价的原材料,又为园艺废弃物的处理提供了科学的解决办法。

通过碱预处理和酶水解,然后进行微生物发酵,从牡丹根(Paeonia ostiipods)中生产聚羟基丁酸酯

Junhua Wang 等人,其中包括 Qingxin Zhou、Jiying Qiu、Yanhao Zhang、Xiangyan Chen、Yifen Wang 和 Leilei Chen

山东农业科学院食品营养科学技术研究所位于济南,邮编 250100,位于中国。

这些作者对这项工作的贡献是相等的。

*Corresponding author.

Abstract

为了进一步发展牡丹(Paeonia ostii)产业,对牡丹荚的再利用方法进行了探索,而牡丹荚此前仅被用作低价值的柴火。在该研究中,对豆荚进行了碱性预处理,以产生可发酵的还原糖用于聚羟基丁酸酯(PHB)的生产。15%。

优化酶学参数提高了水解程度和还原糖产量。当以生产的还原糖替代葡萄糖作为碳源时,PHB 产量增加了 36.67%。

Reference:

WANG J H 等人通过碱预处理、酶水解以及微生物发酵,从 Paeonia ostii 荚果中生产聚羟基丁酸酯。该研究发表于《Journal of Future Foods》2025 年第 5 卷第 5 期,页码为 513 - 519 ,DOI 为 10.1016/j.jfutfo.2024.08.009 。


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